細(xì)胞培養(yǎng)，告別“班味”

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產(chǎn)品速遞

瑞明生物Monicyte活細(xì)胞智能監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，可內(nèi)置于培養(yǎng)箱內(nèi)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞生長(zhǎng)，系統(tǒng)配有強(qiáng)大的AI分析功能，快速合成細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)視頻，分析細(xì)胞密度，匯合度，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，無人值守監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。可應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞遷移，神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，干細(xì)胞分化，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，卵細(xì)胞成熟，類器官生長(zhǎng)等細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。

案例分析

2024年，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院周立全/相文佩/何西淼共同通訊在Advanced Science(IF 14.3)期刊在線發(fā)表了題為“Chromatin Modifier EP400 Regulates Oocyte Quality and Zygotic Genome Activation in Mice”的研究論文，該研究利用條件性敲除小鼠模型，揭示了母源性染色質(zhì)修飾因子EP400維持卵母細(xì)胞質(zhì)量，并通過促進(jìn)H3.3沉積和轉(zhuǎn)錄延伸從而參與調(diào)控小鼠ZGA的過程。

EP400是重要的表觀遺傳調(diào)控因子，在染色質(zhì)重塑、組蛋白乙?；?、組蛋白沉積以及DNA損傷修復(fù)等過程發(fā)揮著重要功能。研究團(tuán)隊(duì)通過分析公共轉(zhuǎn)錄組和翻譯組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，EP400在卵母細(xì)胞至2-細(xì)胞期胚胎存在高水平的表達(dá)。為了檢測(cè)EP400的功能，研究團(tuán)隊(duì)利用 Zp3-Cre/loxP 技術(shù)構(gòu)建了卵母細(xì)胞特異性敲除EP400（EP400 cKO）的小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，EP400 cKO雌鼠生育力顯著下降，而3到4月齡雌鼠則完全不孕。EP400 cKO卵母細(xì)胞表現(xiàn)為DNA損傷增加，以及卵母細(xì)胞成熟和受精障礙，說明EP400 cKO小鼠的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降。此外，母源性EP400缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠早期胚胎在2到4-細(xì)胞階段發(fā)生顯著的發(fā)育阻滯。進(jìn)一步的研究表明，EP400可通過與轉(zhuǎn)錄因子NFYA形成蛋白復(fù)合體，結(jié)合在Major ZGA基因區(qū)域并沉積H3.3，促進(jìn)RNA聚合酶II在Major ZGA基因上的轉(zhuǎn)錄延伸。此外，EP400還調(diào)控了2細(xì)胞期胚胎線粒體調(diào)節(jié)因子和TCA循環(huán)關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而影響早期胚胎發(fā)育的能量代謝和表觀重塑，而進(jìn)一步補(bǔ)充線粒體TCA循環(huán)的關(guān)鍵代謝物α-KG則可以部分挽救母源性EP400敲除導(dǎo)致的早期胚胎發(fā)育阻滯。

圖1. Ep400 調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞質(zhì)量和著床前胚胎發(fā)育機(jī)制示意圖。在卵母細(xì)胞中，Ep400 的缺失會(huì)導(dǎo)致DNA 雙鏈斷裂（DSBs）增加，這可能會(huì)導(dǎo)致線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器分布異常和功能障礙，從而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育并降低其質(zhì)量。在著床前胚胎中，母體儲(chǔ)存的EP400 主要促進(jìn)H3.3 存在和主要ZGA 的轉(zhuǎn)錄延伸，并協(xié)調(diào)組蛋白修，調(diào)節(jié)線粒體等細(xì)胞器的功能，以確保早期胚胎的發(fā)育程序。

在本研究中，作者利用瑞明生物Monicyte活細(xì)胞智能監(jiān)測(cè)系統(tǒng)每隔15 分鐘對(duì)對(duì)照組和cKO 小鼠的生發(fā)泡期（GV）卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)成像，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞培養(yǎng)過程中定時(shí)監(jiān)測(cè)。

圖2.Ep400 缺失卵母細(xì)胞的成熟缺陷及質(zhì)量下降。利用Monicyte活細(xì)胞智能監(jiān)測(cè)系統(tǒng)每隔15 分鐘對(duì)對(duì)照組和cKO 小鼠的生發(fā)泡期（GV）卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)成像。紅色框內(nèi)的圖像顯示了減數(shù)分裂前期Ⅱ（GVBD）發(fā)生的時(shí)間段。比例尺，100 μm。

2025年，周立全研究團(tuán)隊(duì)在Cell Reports雜志上發(fā)表了題為“Deciphering transcription activity of mammalian early embryo unveils on/off of zygotic genome activation by protein translation/degradation”的研究成果。該研究提出了在RNase free條件下通過定量染色質(zhì)上轉(zhuǎn)錄延伸期磷酸化Pol II的信號(hào)富集來反映卵母細(xì)胞和早期胚胎基因轉(zhuǎn)錄活性的方法，簡(jiǎn)稱為RfTAC-seq；系統(tǒng)地繪制和解析了小鼠和人類早期胚胎發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)變化圖譜，并從表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)及蛋白質(zhì)代謝多個(gè)維度，揭示了蛋白質(zhì)翻譯和降解在ZGA基因激活和沉默過程中的調(diào)控作用，為理解胚胎發(fā)育早期的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要的技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

本研究中為了檢測(cè)和量化微量胚胎細(xì)胞中單個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活性，提出了RfTAC-seq 的方法來定量哺乳動(dòng)物基因組中活躍延伸的 Pol II 的富集情況。系統(tǒng)地分析了小鼠和人類植入前胚胎的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)模式，并闡明了ZGA的建立和維持受蛋白質(zhì)翻譯/降解的調(diào)控，而母體衰老可能會(huì)通過此途徑影響胚胎的 ZGA 活性。該研究為哺乳動(dòng)物植入前胚胎中 ZGA 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究提供了新視角。

圖3研究?jī)?nèi)容示意圖

在本研究中，作者從小鼠胚胎干細(xì)胞系A(chǔ)B2.2 中構(gòu)建了一個(gè)熒光小鼠胚胎干細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有MERVL 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的mCherry 報(bào)告基因和ct4 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的eGFP。因此，進(jìn)入2C-like的胚胎干細(xì)胞被紅色熒光標(biāo)記，其余的胚胎干細(xì)胞群體被綠色熒光標(biāo)記。

作者使用MoniCyte 活細(xì)胞智能監(jiān)測(cè)系統(tǒng)每隔30分鐘連續(xù)采集培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞的熒光圖像，總共采集48 小時(shí)。在48 小時(shí)的觀察期內(nèi)，記錄了胚胎干細(xì)胞的動(dòng)態(tài)熒光變化，以供人工檢查和統(tǒng)計(jì)分析

圖4    

 K) 對(duì)照組和經(jīng) CHX/MG132 處理的胚胎干細(xì)胞的延時(shí)成像。箭頭顯示進(jìn)入和退出 2C-like的方向（箭頭）。比例尺，50 μm。L) 箱線圖展示了有無藥物處理情況下進(jìn)入和退出2C-like的時(shí)間。僅記錄了在 48 小時(shí)內(nèi)至少有一次進(jìn)入或退出事件的胚胎干細(xì)胞，并使用雙側(cè)學(xué)生 t 檢驗(yàn)計(jì)算 p 值。E) 經(jīng) CHX/MG132 處理 24 小時(shí)后胚胎干細(xì)胞（ESC）和 2C-like胚胎干細(xì)胞的熒光成像。箭頭指示2C-like胚胎干細(xì)胞群體（紅色）。比例尺，200μm。右側(cè)分別為對(duì)照組和經(jīng) CHX/MG 處理組在 24 小時(shí)后 2C-like胚胎干細(xì)胞熒光面積與總胚胎干細(xì)胞熒光面積比值的柱狀圖。

拓展閱讀

1.“雙管齊下” 瑞明活細(xì)胞監(jiān)測(cè)與單細(xì)胞代謝分析技術(shù)助力腫瘤球融合機(jī)制研究

2. 響應(yīng)國(guó)家政策:瑞明生物助力“儀器設(shè)備更新”

參考文獻(xiàn)

1.Qing Tian , Li-Quan Zhou, et al. Chromatin Modifier EP400 Regulates Oocyte Quality and Zygotic Genome Activation in Mice. Advanced Science (IF 14.3) Pub Date : 2024-03-17 , DOI:10.1002/advs.202308018.

2.Yi-Ran Zhang,  Li-Quan Zhou, et al. Deciphering transcription activity of mammalian early embryo unveils on/off of zygotic genome activation by protein translation/degradation. Cell Reports (IF 7.5) Pub Date : 2025-01-16 , DOI:10.1016/j.celrep.2024.115215.